ISSN:
1871-4528
Keywords:
plant quarantine
;
tuber-bearingSolanum
Source:
Springer Online Journal Archives 1860-2000
Topics:
Agriculture, Forestry, Horticulture, Fishery, Domestic Science, Nutrition
Description / Table of Contents:
Zusammenfassung Es wird eine Methode zur gleichzeitigen Untersuchung von ca. 100 Kartoffelblattmustern auf das Kartoffelspindelknollenviroid beschrieben (von Morris & Smith, 1977, mit kleinen Aenderungen). Die Untersuchungen schützen die Elite-Pflanzgutbestände und Züchtungsprogramme vor der Viroidinfektion fremder Herkunft. Ein roher Extrakt von Kartoffelblatt-Nukleinsäure wird auf Tomatenpflanzen inokuliert. Die letzteren werden mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) ihrer Nukleinsäuren (Abb. 1) nach 35 Tagen in einem Glashaus bei über 25°C mit einer Photoperiode von 18 hauf Viroid untersucht. Die Versuche wurden mit drei Viroidstämmen ausgeführt. Ein Stamm verursacht gewöhnlich starke Symptome auf den Nachweistomatensorten, die beiden andern erzeugen mildere Symptome. Die Stämme werden von importierten, knollenbürtigenSolanum spp. bzw.S. commersonii Dun.,S. gourlayi Hawkes undS. tuberosum L. isoliert. Die in Tomaten vermehrten Isolate waren in 1000X verdünntem Saft für andere Tomate infektiös und konnten in inokulierten Tomatenpflanzen der Sorte Sheyenne mittels PAGE nach 35 Tagen bei 22 oder 30°C nachgewiesen werden. In der Sorte Ailsa Craig wurden sie nach 35 Tagen bei 22°C (Tabelle 1) festgestellt. (Ailsa Craig wurde nicht bei 30°C getestet.) Die Photoperiode betrug 16h mit einer minimalen Intensität von 35W (350μE) m−2 photosynthetisch aktiver Bestrahlung (PAR) aus Fluoreszenzröhren in einer Wachstumskammer. Blattgewebe von den entsprechenden Wirtspflanzen der beiden milden Stämme wurden nach 2 Monaten bei −18°C getestet: das Viroid aus einem von 100 infizierten Blättchen wurde bei Anwendung der Tomaten/PAGE-Methode mühelos nachgewiesen. Ferner wurde die Uebertragung des Viroids auf die Tomatensorte Ailsa Craig weder durch 10- oder 100fache Verdünnung der Nukleinsäureextrakte aus diesen 100 Blattmustern noch durch Beifügung von Nukleinsäureextrakten aus weiteren 20g nicht infizierten Gewebes und nochmals 10facher Verdünnung verhütet. In diesen Versuchen wurden die Tomatenpflanzen in einem Glashaus bei einer Tagestemperatur von 22–25°C und einer minimalen Nachttemperatur von 18°C mit zusätzlicher Beleuchtung für 18h pro Tag gezogen. Das Viroid wurde in allen Pflanzen nach 28 Tagen festgestellt. In der Diskussion wird darauf hingewiesen, dass die kleinste Menge Blattgewebe, das jeder Pflanze entnommen wird, 0,1g und dass die Anzahl Pflanzen pro Test im Maximum 100 betragen soll. Dies, um die Sicherheit negativer Resultate zu erhöhen. Morris & Smith (1977) empfahlen ein Minimum von 0,05g von jeder der 250 Pflanzen für einen zuverlässigen Test von auf kanadischen Feldern angebauten Kartoffeln. Weil die Viroidsynthese in Kartoffeln temperaturabhängig ist (Schumann, 1980), sollten von Pflanzen, die unter kühlen Feldbedingungen angebaut wurden, 0,2g von jeder der 50 Pflanzen entnommen werden. Es wird angenommen, dass es besser ist, Nukleinsäureextrakte aufzubewahren und bei der Inokulation zu vereinigen, als das Gewebe vor der Extraktion zu sammeln. Die zweckdienliche minimale Gewebemenge betrug bei Benützung unserer Einrichtung 2g, um den Extrakt in einem Gang zu gewinnen. Die Viroidsynthese in Tomaten und der nachfolgende Nachweis mittels PAGE scheinen sehr zuverlässige Teile des Testvorganges zu sein. Temperaturen von 22°C genügen, um inokulierte Tomaten anzubauen (Tabelle 1, und Harris & Browning, 1980). Mit einer Photoperiode von 17–18h kann mit niedrigeren Lichtintensitäten die Viroidsynthese kaum entscheidend reduziert werden (Harris & Browning, 1980, haben mit einem schweren Stamm bei 25W m−2 PAR gearbeitet). Eine schmale Bande von Wirts-RNS, genannt 9S-Bande (Abb. 1), deutet auf erfolgreiche Extraktion und Elektrophorese-Verfahren. Die erwartete Lage einer Viroidbande kann mittels der 9S und 5S Wirts-RNS-Banden als Referenz abgeschätzt werden. Ein negatives Ergebnis zeigt sich, wenn die 9S-Bande vorhanden ist, im mittleren Abschnitt des Gels nicht begleitet von einer Bande bei der Viroidstelle. Positive Kontrollen sind deshalb nicht erforderlich. Ein positives Ergebnis kann durch einen wiederholten PAGE-Test an Tomaten und regelmässig zusätzliche Uebertragung auf Tomatenindikatorpflanzen bestätigt werden.
Abstract:
Résumé Une méthode est décrite pour tester 100 échantillons de feuilles de pomme de terre en une seule fois dans la détection du viroïde de la maladie des tubercules en fuseaux de la pomme de terre (d'après Morris & Smith, 1977, avec de légères modifications). Les tests sont destinés à protéger les familles d'élites et les programmes d'hybridation de l'infection viroïde provenant d'origines étrangères. Un extrait de feuilles de pommes de terre infectées est inoculé à des tomates. Ces dernières sont cultivées pendant 35 jours en serre, à une température supérieure à 25°C, avec une photopériode de 18 heures; l'acide nucléique du viroïde est isolé de ces dernières (fig. 1) et examiné à l'aide de l'électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE). Les expériences ont été faites avec trois souches de viroïdes. Une souche cause habituellement des symptômes sévères sur les variétés-tests de tomate; les deux autres provoquent des symptômes modérés. Les souches ont été isolées de tubercules importés deSolanum ssp., respectivementS. commersonii Dun,S. gourlayi Hawkes etS. tuberosum L. Les isolats issus de tomates ont servi d'inoculum à d'autres tomates après dilution dujus de 1000 fois, et le viroïde a été détecté chez les tomates infectées de la variété Sheyenne par PAGE après 35 jours de culture à 22 ou 30°C. Il a été détecté chez la variété Ailsa Craig après 35 jours de culture à 22°C (tableau 1). (Cette dernière n'a pas été testée à 30°C.) La photopériode était de 16 heures avec une intensité minimum de 35W (350μE) m−2 en radiation photosynthétiquement active (PAR) donnée par des tubes fluorescents placés dans la chambre de culture. Les tissus foliaires des hôtes respectifs des deux souches modérées ont été testés après deux mois de conservation à −18°C: le viroïde d'une foliole infectée des 100 échantillons a rapidement été détecté par la méthode tomate/PAGE. De plus, les extraits d'acide nucléique de ces 100 folioles dilués 10 ou 100 fois, ou bien additionnés d'extraits d'acides nucléiques provenant d'une autre extraction de 20g de tissus non-infectés diluée au 1/10, permettaient la transmission à la variété Ailsa Craig. Dans ces expériences, les pieds de tomate ont été cultivés en serre à la température diurne de 22–25°C et à la température nocturne minimum de 18°C avec un éclairement complémentaire de 18 heures par jour. Le viroïde a été détecté dans toutes les plantes après 28 jours. A la discussion, il est suggéré que la quantité minimum de tissus de feuilles à prélever par plante est de 0,1g et que le nombre maximum de plantes par test est de 100. Cela permet d'augmenter la confiance dans les résultats négatifs. Morris & Smith (1977) proposent un prélèvement minimum de 0,05g pour chacune des 250 plantes du test effectué dans les terrains de culture canadiens. Parce que la synthèse du viroïde dépend de la température de croissance des pommes de terre (Schumann, 1980) un échantillon de 0,2g pourrait être prélevé sur 50 plantes lorsque celles-ci sont cultivées en sols froids. On pense qu'il est probablement préférable de concentrer l'inoculum après extraction plutôt que d'utiliser beaucoup de tissus foliaires pour l'extraction. La possibilité d'extraction avec la quantité minimum de tissu de notre équipement, pour une seule utilisation, est de 2g. La synthèse du viroïde dans la tomate et sa détection par PAGE paraissent être en bonne relation. Des températures aussi basses que 22°C sont adéquat pour la croissance des tomates inoculées (tableau 1; Harris & Browning, 1980). Avec une photopériode de 17–18 heures, une intensité lumineuse plus basse ne gêne vraisemblablement pas de façon critique la synthèse du viroïde (Harris & Browning, 1980, travaillent avec la souche sévère à 25W m−2 PAR). Une mince bande de l'ARN de l'hôte, appelée 9S (fig. 1) est l'indice d'une bonne extraction et d'une électrophorèse convenable. La position de la bande correspondant au viroïde peut être convenablement estimée en se référant aux bandes 9S et 5S de l'ARN de l'hôte. Un résultat négatif est constaté quand la bande 9S est présente mais qu'il n'existe pas dans la partie moyenne du diagramme de bande signalant la présence du viroïde. Des contrôles positifs ne sont donc pas nécessaires. Un résultat positif peut être confirmé par une répétition du test PAGE de la tomate accompagné de la transmission à des plantes-tests (tomate).
Notes:
Summary A method is described for detecting PSTV in bulked potato leaf samples. Nucleic acids from 0.1g from each of 100 potato leaves are inoculated to tomato seedlings that are checked for viroid by PAGE of their nucleic acids after 35 days above 25°C. Viroid strains previously isolated from three tuber-bearingSolanum species were infective to tomato in sap diluted X1000 and were detected by PAGE after 28 days at about 22°C. Simulated tests showed that viroid from one infected potato leaflet in 100 was readily detected. Furthermore, diluting nucleic acid extracts from these 100-leaflet samples X10 or X100, or adding to the extracts nucleic acid from a further 20g of healthy tissue and diluting X10, did not prevent transmission to tomato. The practical use of the test is discussed, and lowered viroid concentration in potato sources grown in cool conditions considered.
Type of Medium:
Electronic Resource
URL:
http://dx.doi.org/10.1007/BF02357322
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