FÄrbungsanalysen zur Acridinorange-Fluorochromierung

Zusammenfassung

Am fixierten Gewebe des Kleinhirnes der Maus wurden färbungsanalytische Untersuchungen zur Acridinorange-Fluorochromierung durchgeführt. Die erzielten Bilder der Fluoreszenzfärbung wurden dabei verglichen mit denen der Eigenfluoreszenz des Gewebes, der für Nukleinsäuren unter bestimmten Bedingungen spezifischen Gallocyanin-Chromalaun-Färbung sowie der nur hochpolymere Desoxyribonukleinsäure darstellenden Methylgrün-Färbung. Die wesentlichen Ergebnisse unserer Untersuchungen können in folgenden Punkten zusammengefaßt werden:

• 1. Dieprimäre Fluoreszenz des ungefärbten Kleinhirngewebes ergibt bereits ein kontrastreiches Bild, in dem insbesondere die Nissl-Substanz der chromophilen Purkinje-Zellen eine erhebliche Fluoreszenz-Intensität aufweisen. Die Zellkerne zeigen keine oder eine nur sehr geringe Fluoreszenz.

• 2. Diese starke Eigenfluoreszenz der Nissl-Substanz ist nach Versuchen mit Nukleinsäure-Extraktion auf deren nukleinsäurefreien Restkörper zurückzuführen.

• 3. Bei derFluorochromierung des Gewebes mitAcridinorange in gestuft gepufferten Farblösungen ist an allen nukleinsäurehaltigen Zellstrukturen im Bereich vonph 0,65–1,5 eine mit abnehmender Wasserstoffionen-Konzentration der Farblösung zunehmende Anfärbung festzustellen. Bei höherenph-Werten bis 8,0 wird sowohl an den ribonukleinsäurehaltigen wie auch an den nukleotidfreien Gewebselementen eine zunehmende Farbbindung beobachtet. Die Zellkerne weisen dagegen nur bis einschließlichph 2 eine zunehmend stärkere Farbbindung auf, abph 3 wird eine Umkehr im Verhalten der Farbbindung mit zunehmender Verringerung der gebundenen Farbstoffmenge beobachtet.

• 4. Färbungen im Bereich vonph 0,65–1,5 ergeben ein morphologisches Bild der Acridinorange-Fluorochromierung, das gut vergleichbar ist mit dem der Gallocyanin-chromalaun-Färbung, da wie bei dieser ausschließlich die nukleinsäurehaltigen Zellstrukturen angefärbt werden. Intensität der Gallocyanin-Chromalaun-Färbung und Fluoreszenzfarbe sowie -intensität bei der Acridinorange-Fluoreszenz entsprechen sich weitgehend.

• 5. Oberhalb vonph 1,5 zeigt ähnlich wie die Gallocyanin-Chromalaun-Färbung auch die Acridinorange-Fluorochromierung eine mit abnehmender Wasserstoffionen-Konzentration der Farblösungen zunehmende Mitfärbung der nukleinsäurefreien Gewebsstrukturen, die jedoch im Gegensatz zur Gallocyanin-Chromalaun-Färbung keine Verminderung oberhalb vonph 3,5 aufweist.

• 6. Extraktionsversuche mit Äthyl- und Isopropylalkohol sowie Färbungen nach Entfernung der Nukleinsäuren aus den Zellstrukturen zeigen, daß ein Teil des bei der Färbung an Nukleoproteide gebundenen Acridinorange mit den Nukleinsäuren eine elektrostatische heterologe Valenzbindung salzartiger Natur unter Wirkung coulombischer Kräfte eingeht. Ein zweiter Teil des Farbstoffes ist dagegen lockerer nach Art einer Kohäsionsbindung an die Nukleinsäuren fixiert.

• 7. An hochpolymerer Desoxyribonukleinsäure der Zellkerne tritt im Bereich vonph 3–8 eine Verringerung der Farbstoffbindung ein, die nach Depolymerisation nicht mehr nachweisbar ist und die auf eine sterische Behinderung der Farbstoff-Bindung zurückgeführt wird. Mit Acridinorange ist dabei eine erfolgte Depolymerisation früher nachweisbar als durch die Methylgrün-Färbung.

• 8. Die nukleinsäurefreien Gewebestrukturen besitzen im untersuchten Kleinhirngewebe eine Farbstoff-Bindung, die in einem engumgrenztenph-Bereich (ph 5–7) eine starke Zunahme aufweist. Dieserph-Bereich entspricht dem apparenten isoelektrischen Punkt oder „Umladebereich“ dieser Strukturen, die somit eine elektrochemisches Verhalten wie reine Aminosäuren erkennen lassen. An niederpolymeren Nukleinsäuren und den diese Substanzen enthaltenen Zellstrukturen dagegen erstreckt sich die Zunahme der Farbbindung über eine weiteph-Spanne. Dieser Befund entspricht den Erwartungen, da nach den Kenntnissen der Elektrochemie ein ausgedehnterer Umladebereich zu erwarten ist, wenn an einem Ampholyten die Ladungsstärke der sauren und basischen Gruppen sehr differiert, wie dies bei den Nukleinsäuren der Fall ist.

Summary

Studies on the physico-chemical mechanisms of staining with the fluorochrome acridine orange were done on slices of fixed cerebellum of mice. The obtained fluorescent staining pattern was compared with the autofluorescence of cerebellar tissue, with gallocyanin-chromalum staining, which shows a high specifity for nucleic acids, and with methyl green staining, which reacts only with highly polymerized desoxyribonucleic acid.

When stained with acridine orange at differentph values (ph 0.65–8.0) the ribonucleic acids containing Nissl-substance of the Purkinje-cells binds increasing amounts of the dye with risingph.

The intercellular parts of the tissue show a strong affinity for acridine orange only atph values aboveph 6.0.

In contrast to the Nissl-substance the highly polymerized desoxyribonucleic acid of the nuclei binds increasing amounts of acridine orange only up toph 3.0. But after depolymerisation the desoxyribonucleic acid behaves like ribonucleic acid.

Extraction of the dye with alcoholic solutions and also staining after removal of the nucleic acids shows that acridine orange is bound on the nucleic acids in two different ways: one part of the dye reacts with nucleic acids by an electrostatic heterologous bond of salt like character; the other part is bound with the aid of cohesion (e.g.van der Waals forces).