Optimierung und Strategie der Gelelektrophorese

Summary

The objective definition of optimal fractionation conditions for separating charged molecules by gel electrophoresis is possible. Optimization implies that differences among molecular species in all of their major properties, namely net charge, size and relative hydrophobicity, are exploited for the purpose of separation. A suitable strategy would initially define a solvent and detergent milieu capable of dissolving the species of interest with maintenance of at least a substantial part of the activity of the molecule (if any). This is being followed by a systematic scrutiny of the molecular charge differences between the species by varying the pH of gel electrophoresis, starting at one or both extremes of pH and moving toward neutrality. This is best done using stacking gels by analysis for the protein of interest of a single gel slice containing the stack at each pH. This is being followed by a scrutiny of molecular size differences through gel electrophoresis at several gel concentrations, measurement of relative mobility (R_F) in each for both the species of interest and its closest migrating contaminants. The data allow one to compute the Ferguson plots (log R_F vs. %T) for each species, the molecular sizes and net charges (the slopes and y-intercepts of these plots), and the optimal gel concentration for the resolution of the species of interest from its neighbors. If that analysis indicates an optimum at 0 % gel concentration, the use of isoelectric focusing or of isotachophoresis for the particular separation problem are objectively indicated.

Zusammenfassung

Es ist möglich, die optimalen Trennungsbedingungen für Moleküle mit Ladung in der Gelelektrophorese objektiv zu bestimmen. Dabei bedeutet optimal, daß die molekularen Unterschiede in bezug auf Ladung, Größe und relative Hydrophobizität zum Zweck der Trennung ausgenützt werden. Eine geeignete Strategie wird erst Lösungsmittel und eventuell Detergentien definieren, die fähig sind, das interessierende Molekül zu lösen und wenigstens einen Teil seiner Aktivitäten (wenn es solche besitzt) beizubehalten. Danach folgt eine systematische Suche nach Unterschieden in der Ladung der verschiedenen zu trennenden Molekülarten durch Einsatz der Gelelektrophorese bei verschiedenen pH-Werten, die man von den pH-Extremen her auf den neutralen pH hin verändert. Als Mittel dazu dient das Stapelgel (Stacking Gel), das es erlaubt, durch Analyse einer einzigen Gelscheibe, die den Stapel enthält, die Möglichkeit der Trennung bei jedem pH festzustellen. Darauf folgt eine Methode, die die molekularen Größenunterschiede für die Trennung ausnutzt und auf der Gelelektrophorese bei verschiedenen Gelkonzentrationen beruht. Die relativen Wanderungsgeschwindigkeiten (R_F) werden bei jeder Gelkonzentration für das interessierende Molekül und seine benachbart wandernden Verunreinigungen gemessen. Diese Werte erlauben es, den Ferguson-Plot (log R_F vs. %T) für jede Molekülarart aufzustellen. Aus den Steigungen und y-Abschnitten der Ferguson-Plots werden Molekülgröße und Ladung berechnet, sowie die optimale Gelkonzentration für die Trennung jeder Molekularart von einer anderen. Wenn diese Rechnung auf ein Trennungsoptimum bei 0% Gelkonzentration hinweist, ist der Einsatz des isoelektrischen Fokussierens oder der Isotachophorese objektiv gerechtfertigt.