ISSN:
1432-072X
Source:
Springer Online Journal Archives 1860-2000
Topics:
Biology
Description / Table of Contents:
Zusammenfassung Mit Hilfe der im ersten Teil dieser Arbeit (Reiss, 1967b) beschriebenen Methodik konnten bei den Pilzen Neurospora crassa, Oospora lactis und Saccharomyces cerevisiae folgende Dehydrogenasen cytochemisch nachgewiesen werden: 1. Embden-Meyerhof-Weg: NAD-gebundene α-Glycerophosphat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.8), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), D-Lactat: Cytochrom c-Oxydoreduktase (E. C. 1.1.2.4), L-Lactat-Cytochrom c-Oxydoreduktase (E. C. 1.1.2.3). Bei N. crassa konnte zusätzlich noch die Anwesenheit der NAD-gebundenen D-Lactat-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.28) lokalisiert werden. 2. Hexosemonophosphat-Weg: Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.49) und 6-Phosphogluconsäure-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.44). 3. Citronensäure-Cyclus: NAD- und NADP-gebundene Isocitrat-Dehydrogenasen (E. C. 1.1.1.41 und 1.1.1.42), NAD- und NADP-gebundene Glutaminsäure-Dehydrogenasen (E. C. 1.4.1.2 und 1.4.1.4), Succinat-Dehydrogenase (E. C. 1.3.99.1) und jeweils ein mit NAD und NADP verknüpftes, Malat dehydrierendes Enzym. 4. Cytochrom c-Reduktasen: NAD-H2-Cytochrom c-Reduktase (E. C. 1.6.2.1) und NADP-H2-Cytochrom c-Reduktase (E. C. 1.6.2.3). Lediglich bei N. crassa konnte bei Verwendung einiger L-Aminosäuren als Substrat eine schwache L-Aminosäure-Dehydrogenase-Aktivität (E. C. 1.4.3.2) nachgewiesen werden, bei keinem der untersuchten Pilze jedoch eine D-Aminosäure-Dehydrogenase (E. C. 1.4.3.3) und ebenfalls keine Monoaminoxydase (E. C. 1.4.3.4). Die möglichen Ursachen für das Ausbleiben jeglicher Reaktion bei diesen beiden Enzymen werden diskutiert. Die optimale Inkubationszeit für fast alle Enzyme betrug 30 min. Die Tetrazoliumsalze Nitro-BT und Tetranitro-BT erwiesen sich als gleichermaßen gute Indicatoren, während das MTT-Co2ü-Verfahren wegen des toxischen Einflusses des CoCl2-Zusatzes bei manchen Dehydrogenasen nicht angewendet werden kann. Bei einem positiven Dehydrogenasen-Nachweis waren die Formazan-Granula bei allen Pilzen stets gleichmäßig im Cytoplasma verteilt. Ihre Gestalt war bei Oospora und Neurospora rund bis höchstens leicht elliptisch, lediglich bei Saccharomyces traten beim Nachweis verschiedener Dehydrogenasen zusätzlich noch längliche, fadenförmige Strukturen auf, die als Mitochondrien anzusprechen sind. Inwieweit beim Nachweis dieser Enzyme auch die normalen runden Reaktionspunkte mit Mitochondrien identisch sind, konnte nicht exakt geklärt werden. Ausführliche Kontrolluntersuchungen zu jedem einzelnen Enzymnachweis bestätigen in weitem Maße die Spezifität der angewandten Nachweisreaktionen. Drei Nachteile konnten bei Anwendung der Methodik gefunden werden: 1. Verschiedene mit dem gleichen Coenzym verknüpfte Enzyme, die das gleiche Substrat zu verschiedenen Endprodukten abbauen, können nicht voneinander getrennt werden (z. B. NADP-gebundene Malat-Dehydrogenase und NADP-gebundenes “malic enzyme”), 2. Enzyme, die einmal mit einem Pyridinnucleotid und ein anderes Mal mit dem Cytochromsystem direkt verbunden sind, können nicht exakt unterschieden werden (z. B. L-Lactat: NAD-Oxydoreduktase und L-Lactat: Cytochrom c-Oxydoreduktase), 3. Bei Ausbleiben einer Formazanbildung kann nicht mit Sicherheit entschieden werden, ob das Enzym fehlt oder lediglich in sehr schwacher Aktivität vorliegt.
Notes:
Summary Using the methods, which are described in the first part of this paper (Reiss, 1967b), the following dehydrogenases could be detected cytochemically in the fungi Neurospora crassa, Oospora lactis and Saccharomyces cerevisiae: 1. Embden-Meyerhof pathway: L-glycerol-3-phosphate: NAD oxidoreductase (E. C. 1.1.1.8), alcohol dehydrogenase (E. C. 1.1.1.1), D-lactate: cytochrome c oxidoreductase (E. C. 1.1.2.4), L-lactate: cytochrome c oxidoreductase (E. C. 1.1.2.3). In N. crassa the presence of D-lactate: NAD oxidoreductase (E. C. 1.1.1.28) could be localized additionally. 2. Hexosemonophosphate pathway: glucose-6-phosphate dehydrogenase (E. C. 1.1.1.49) and 6-phosphogluconate dehydrogenase (E. C. 1.1.1.44). 3. Citric acid cycle: NAD- and NADP-linked isocitrate dehydrogenases (E. C. 1.1.1.41 and 1.1.1.42), NAD- and NADP-linked glutamic acid dehydrogenases (E. C. 1.4.1.2 and 1.4.1.4), succinate dehydrogenase (E. C. 1.3.99.1) and two malate dehydrogenating enzymes, one specific for NAD, the other for NADP. 4. Cytochrome c reductases: NAD-H2: cytochrome c reductase (E. C. 1.6.2.1) and NADP-H2: cytochrome c reductase (E. C. 1.6.2.3.). Using some L-amino acids as substrate a weak L-amino acid dehydrogenase activity (E. C. 1.4.3.2) could only be localized in N. crassa. In all three fungi D-amino acid dehydrogenase (E. C. 1.4.3.3) and monoamine oxidase (E. C. 1.4.3.4) were not detectable. The optimal incubation period for nearly all enzymes was 30 min. The tetrazolium salts Nitro-BT and Tetranitro-BT proved to be nearly equally good indicators whereas the MIT-Co2ü method could not be used for the detection of some dehydrogenases because of the toxic effect of the CoCl2 solution. The formazan deposits were always equally distributed in the cytoplasm of all three fungi. The shape of the reaction products was round or lightly elliptic in Neurospora and Oospora; only in Saccharomyces some enzymes, which are mitochondrial according to biochemical investigations, additionally created long, filamentous structures which must be identified as mitochondria. It could not be exactly evaluated if the usually round formazan granules of Neurospora and Oospora are also identical with mitochondria. Using the techniques for the intracellular localization of dehydrogenases three disadvantages could be detected: 1. Different enzymes which are linked to the same coenzyme but catalyze different reactions cannot be separated (i.e. NADP-linked malate dehydrogenase and NADP-linked malic enzyme), 2. Enzymes responsible for the same reaction but linked to a pyridine nucleotide respectively to cytochrome c cannot be distinguished exactly (i.e. L-lactate: NAD oxidoreductase and L-lactate: cytochrome c oxidoreductase), 3. From the lacking of a formazan production it cannot be decided whether the enzyme is absent or only too weak for the reduction of the tetrazolium salt.
Type of Medium:
Electronic Resource
URL:
http://dx.doi.org/10.1007/BF00416933
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