ISSN:
1432-072X
Source:
Springer Online Journal Archives 1860-2000
Topics:
Biology
Description / Table of Contents:
Zusammenfassung An Rohextrakten aus Hydrogenomonas H 16 und davon abgeleiteten Mutanten wurden die regulatorischen Eigenschaften der Threonin-Desaminase und der Acetohydroxysäure-Synthase untersucht. 1. Die Aktivität der Threonin-Desaminase wurde nach zwei Verfahren im zusammengesetzten optischen Test an der NADH2-Oxydation gemessen: durch Umsetzung des entstehenden Ammoniaks mit Glutamat-Dehydrogenase zu Glutamat und durch Reduktion des entstehenden α-Ketobutyrats durch Lactat-Dehydrogenase zu α-Hydroxybutyrat. Das pH-Optimum liegt in Tris-Puffer bei pH 9,0. Die Desaminierungsreaktion wird bereits durch 0,3 mM L-Isoleucin vollständig gehemmt. Die Hemmung läßt sich durch L-Valin teilweise aufheben. Die Substrat-(Threonin)-Sättigungskurve hat paraboloiden, in Gegenwart von Isoleucin (0,05 mM) sigmoiden Verlauf. Der Hill-Koeffizient beträgt in Abwesenheit des Inhibitors n=1,1 und in Gegenwart von Isoleucin n=2,4 (pH 8,3). 2. Von einer isoleucin-auxotrophen Mutante, deren Threonin-Desaminase defekt ist, wurde eine prototrophe Revertante isoliert, die Isoleucin ausscheidet. Die Threonin-Desaminase dieser Mutante unterscheidet sich vom Wildtypenzym durch eine verminderte Affinität für Isoleucin; halbmaximale Hemmung erfolgt bei 2,5 mM Isoleucin gegenüber 0,2 mM beim Wildtypenzym. 3. Die Acetohydroxysäur-Synthase wird bei pH 9,0, dem pH-Optimum der katalytischen Aktivität, durch L-Valin zu 25% gehemmt; bei pH 7,4 bewirken 0,1 mM L-Valin eine 50%ige Hemmung. Die Hemmung ist spezifisch; L-Isoleucin und L-Leucin bewirken weder eine Aktivitätsminderung, noch wirken sie antagonistisch. 4. Während des Wachstums einer isoleucin-valin-auxotrophen Mutante im Chemostaten werden bei Wachstumsbegrenzung durch L-Valin beide Enzyme, die Threonin-Desaminase und die Acetohydroxysäure-Synthase, dereprimiert gebildet. Wachstumsbegrenzung durch Isoleucin führt zur Derepression der Bildung der Threonin-Desaminase.
Notes:
Summary Threonine desaminase and acetohydroxyacid synthase in cell-free extracts of Hydrogenomonas H 16 and mutants derived therefrom have been studied with respect to their regulatory properties. 1. The activity of threonine desaminase has been determined employing two combined optical tests using the oxidation of NADH2 as indicator system: by trapping the ammonia produced through glutamate dehydrogenase and α-ketoglutarate and by reducing the α-ketobutyrate produced through lactate dehydrogenase. Optimum pH has been found to be 9.0 in tris-buffer. The desaminase reaction is completely inhibited already by 0.3 mM L-isoleucine. The inhibition is partially relieved by L-valine. The substrate (threonine) saturation curve has paraboloid shape; in the presence of isoleucine (0.05 mM) its shape is sigmoid. The Hill-coefficient in the absence of the inhibitor is n=1.1 and in the presence of L-isoleucine is n=2.4 (pH 8.3). 2. A prototrophic revertant has been isolated from an isoleucine requiring mutant defective in threonine desaminase. This revertant excretes isoleucine. The threonine desaminase of this revertant differs from the wildtype enzyme by a diminished affinity for isoleucine; half maximal inhibition occurs at 2.6 mM isoleucine in contrast to 0.2 mM at the wildtype enzyme. 3. The acetohydroxyacid synthase has its pH optimum at 9.0. At this pH the inhibition by L-valine amounts to 25%. At pH 7.4 a 50% inhibition was observed at a 0.1 mM concentration of valine. By varying the magnesium concentration an 80% inhibition was observed at 0.2 mM valine. The sensitivity of the enzyme is specific for L-valine; L-isoleucine and L-leucine neither decrease the activity nor act antagonistically. 4. When an isoleucine-valine-auxotrophic mutant was grown in a chemostat and when growth was limited by the concentration of valine, the formation of both enzymes, threonine desaminase and acetohydroxyacid synthase, became derepressed. When growth was limited by the concentration of isoleucine only threonine desaminase became derepressed.
Type of Medium:
Electronic Resource
URL:
http://dx.doi.org/10.1007/BF00409677
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